• - 流动相准备：根据实验需求选择合适的流动相，例如甲醇、乙腈、水等，以及相应的添加剂（如缓冲盐等）。将流动相用合适的滤膜（有机系或水系，常用孔径为0.20μm或0.45μm）进行过滤，以去除其中的杂质。将过滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟，去除溶解在其中的气体，防止在仪器中形成气泡影响分析结果。

• - 样品准备：确保样品溶解均匀且无杂质。如果样品是固体，需要将其完全溶解在合适的溶剂中；如果样品是液体，需要进行适当的稀释或前处理。对样品溶液也需要进行过滤，防止堵塞进样系统和色谱柱。

• - 根据样品的性质和分析目的选择合适的色谱柱。例如，对于极性较大的样品，可选择反相色谱柱（如C18柱）；对于极性较小的样品，正相色谱柱可能更合适。同时，要注意色谱柱的规格（如长度、内径、粒径等）对分离效果的影响

•  打开硬件设备：先打开计算机，进入操作系统后，再打开液相色谱仪的各个模块电源，如泵、检测器、柱温箱等。等待各模块完成自检。

• 打开软件：双击液相色谱仪的工作站软件图标，进入软件操作界面。在软件中进行联机操作，使计算机与液相色谱仪建立通讯。

• 冲洗系统：在仪器操作界面中设置泵的参数，用甲醇或其他合适的溶剂作为初始流动相，以一定的流速冲洗整个液相色谱系统，包括泵、管路、进样阀、色谱柱和检测器等。冲洗时间一般为20-30分钟，目的是去除系统中的杂质和残留物质，同时检查系统是否存在漏液等问题。

• 设置柱温：根据实验要求，在柱温箱上设置合适的温度，使色谱柱达到稳定的工作温度。一般来说，柱温的设置需要考虑色谱柱的类型、样品的性质以及分析方法的要求。

• 基线稳定：在冲洗过程中，观察检测器的信号，等待基线稳定。基线稳定的标准通常是基线的波动在一定范围内，且在一段时间内保持相对稳定。这可能需要30分钟或更长时间，具体取决于仪器的状态和分析方法。

• 泵参数设置：设置流动相的流速、比例等参数。如果是梯度洗脱，还需要设置梯度程序，即不同时间点流动相的组成变化。

• 检测器参数设置：设置检测波长、带宽、响应时间等参数。根据样品的特性和分析目的选择合适的检测波长，以获得最佳的检测效果。

• 进样器参数设置：如果是自动进样器，设置进样体积、进样方式、清洗次数等参数；如果是手动进样器，需要练习正确的进样操作手法，确保进样的准确性和重复性。

• 其他参数设置：根据实验需求，还可以设置其他相关参数，如柱温箱的温度控制程序、数据采集的频率等。

•  进样前准备：如果是自动进样器，将样品瓶放入自动进样器的样品架上，并在软件中设置好样品信息；如果是手动进样器，用洗针液洗净进样针，再用样品溶液润洗进样针3遍以上，并排除针筒中的气泡。

• 进样操作：对于自动进样器，在软件中点击开始进样按钮，自动进样器会按照设定的程序进行进样；对于手动进样器，将进样针插入进样阀的进样口，缓慢注入样品溶液，然后切换进样阀的位置，启动进样程序。进样完成后，记录样品的名称、进样时间等信息。

• 数据采集：在进样后，液相色谱仪会自动采集样品的色谱数据，并将其传输到计算机上的工作站软件中。

• 数据处理：对采集到的数据进行处理，包括积分、峰识别、峰面积计算、保留时间确定等。可以根据需要设置积分参数、峰的判定标准等，以获得准确的分析结果。

• 数据分析：根据处理后的数据，对样品的组成、含量、纯度等进行分析和判断。可以通过比较样品的色谱图与标准品的色谱图，或者使用标准曲线法等方法进行定量分析。

• 样品处理：取出样品瓶，将剩余的样品进行妥善处理，如回收、废弃等。如果样品具有危险性或腐蚀性，需要按照相关规定进行处理。

• 系统清洗：用适当的溶剂（如甲醇、水等）冲洗液相色谱系统，特别是泵、进样阀和色谱柱等部件，以去除残留的样品和流动相。清洗时间一般为30分钟以上，确保系统清洗干净。

1、在使用过含盐缓冲液后必须清水冲洗泵15分钟，

此时必须打开排放阀，不能使废液进入色谱柱。

2、关上排放阀，用90%+10%的水、甲醇溶液冲洗整个系统，

时间为15~20分 钟，流量1ml/min。

本步骤主要是冲洗干净系统内其他含盐的部位。

3、用纯的强溶剂冲洗整个系统，本步骤主要是保护色谱柱。

4、如果未使用缓冲液，上面1、2两步骤可免去，直接用纯的强溶剂冲洗整个系统

5、清洗进样针时，溶剂的选择取决于样品的性质。

如果样品是水溶性的，像各种盐溶液、水溶性维生素等，一般可以使用水和甲醇的混合溶液来清洗，也可以单独使用甲醇或者乙腈。这些有机溶剂能有效溶解和清除样品残留。

对于非水溶性样品，例如油脂、脂溶性维生素等，通常会先使用非极性有机溶剂如正己烷、甲苯等来清洗，把大部分的油性残留洗去。之后再用甲醇等能与水互溶的有机溶剂冲洗，这样可以确保进样针清洗得更干净。

此外，如果是蛋白质、多肽等生物样品，为防止变性和残留，可以使用专门的缓冲液（如磷酸盐缓冲液）进行初步清洗，再用适当的有机溶剂进一步清洗。

先关闭液相色谱仪的软件，然后依次关闭检测器、泵、柱温箱等模块的电源，最后关闭计算机。

1. 泵压问题：

压力高：可能是由于方法问题、误操作、系统堵塞或压力传感器故障引起。

解决方法：检查柱温、流动相溶剂、色谱柱是否正确，以及检查系统是否有堵塞并进行清洗或更换相关部件。

压力低：可能是由于误操作、漏液或泵不输液引起。

解决方法：检查泵是否关闭、排空阀是否打开、溶剂瓶内是否有溶剂、管路中是否充满气体等，并进行相应的处理。

2. 色谱峰问题：

拖尾峰：可能是由于筛板阻塞、色谱柱塌陷、样品不在同一起跑线起跑或流动相pH值选择错误引起。

解决方法：反冲色谱柱、更换筛板、冲洗柱子或调节pH值。

前沿峰：可能是由于样品过载、样品溶剂选择不恰当、色谱柱损坏或在大峰前有小峰出现。

解决方法：降低样品含量、选择合适的样品溶剂、更换色谱柱或调整流动相洗脱梯度。

倒峰：可能是由于样品折射率小、密度原因、进样所致或基本不可避免。

解决方法：使用与流动相相同的溶剂作为溶样溶剂，注意平衡跟冲洗参比池。

3. 基线漂移：

可能是由于柱温波动、流动相不均匀、流通池被污染或有气体、流动相配比不当或流速变化、样品中有强保留的物质。

解决方法：使用柱温箱、控制好柱子和流动相的温度、使用HPLC级的溶剂、定期检查流动相组成及流速、使用保护柱或定期用强溶剂冲洗柱子。

4. 出现宽峰：

可能是由于色谱柱污染或失效、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大、检测器对反应时间或池体积响应过大。

解决方法：更换色谱柱、更换内径较小的短管路、减少响应时间或使用更小的流通池。

5. 基线噪音：

可能是由于流动相、检测器或泵中有空气、漏液、流动相混合不完全、温度影响或在同一条线上有其他电子设备。

解决方法：流动相脱气、检查管路接头、流动相混合均匀、使用柱温箱、断开LC、检测器和记录仪检查干扰来源。

6. 分离度不够：

可能是由于流动相梯度洗脱设置不合理、流动相污染或变质、保护柱或分析柱阻塞。

解决方法：优化梯度洗脱程序、重新配置流动相、去掉保护柱进行分析或更换保护柱。

7. 接头处漏液：

可能是由于接头处松动、过紧、磨损、被污染、不匹配。

解决方法：拧紧接头或更换管路。

8. 进样阀漏液：

可能是由于转子密封圈磨损太厉害或者损坏、废液管产生虹吸或者堵塞、进样口密封松动或者进样针头尺寸不合适。

解决方法：更换密封圈、保持废液管高于废液液面或更换疏通废液管、调整进样口的密封圈或更换合适的进样针头。

9. 泵漏液：

可能是由于单向阀、接头松动、柱塞杆磨损刮伤或者柱塞密封垫损坏导致的柱后漏液、比例阀损坏。

解决方法：检查手紧接头、更换柱塞杆或柱塞密封垫、检查隔膜并更换。

10. 检测器漏液：

可能是由于流通池垫片损坏、废液管破裂、流通池阻塞。

解决方法：检查垫片并更换、检查管路并更换、清洗流通池并更换或池子窗口。

11. 色谱柱漏液：

可能是由于流动相常见问题。

解决方法：定期更换柱塞杆密封以避免柱塞密封的磨损。

以上是液相色谱仪的一些常见问题及其解决方法，实际操作时可能需要根据具体情况进行调整。

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