液相色谱（Liquid chromatography 简称LC）是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行先分离，而后分析鉴定的仪器。
液相色谱仪的结构及原理
一.结构
高效液相色谱仪主要由储液器、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪六部分组成。
1、储液器
储液器是用于存放溶剂的装置。贮液器中的溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性，一般情况下通常采用1升~2升的大容量玻璃瓶，也可采用不锈钢制成的容器，贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内，溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，孔隙大小一般为2μm。
2、高压泵
高压泵应耐压、耐腐蚀、密封性好。其主要用于输送流动相，其压力一般为几兆帕至数十兆帕，这时液体的黏度比气体大 100 倍。同时由于固定相的颗粒极细，柱内压降大，为保证一定的流速，必须借助高压迫使流动相通过柱子。高压泵应无脉动或脉动极小，以保证输出的流动相具有恒定的流速，同时采用脉动阻尼装置可将产生的脉动除去，使流动相的流量变动范围不宜超过 2%~3%。高压泵主要分为恒压泵、恒流泵和螺旋传动注射泵三类。
（1）恒压泵
恒压泵输出的压力恒定，当具有一定压力的气体作用在一个大面积活塞上,大面积活塞再驱动一个小面积活塞，小面积活塞承受的压力是大面积活塞的几十倍，从而得到压力恒定的流出液。
（2）恒流泵
恒流泵的主要功能是输出的流量恒定，如往复柱塞泵、螺旋传动注射泵等。往复柱塞泵与恒压泵不同，通常采用电驱动活塞，当活塞迅速向上动时，由于减压使入口止逆阀开启，出口止逆阀关闭，贮液器中的流动相被吸入柱内，形成一个循环，然后再开始下一个循环。使用这种泵时一定要连接脉动阻尼器，将产生的脉动除去，若采用双活塞泵，使双活塞在相移180°下工作，可使脉动互相抵消，减小噪声。往复柱塞泵的流量与外界阻力无关，恒流泵具有体积小的特点，非常适合于梯度洗脱。
（3）螺旋传动注射泵
螺旋传动注射泵是用电力以很慢的恒定速率驱动活塞，使流动相连续输出，当活塞到达末端时，输出中止，然后由另一个吸入冲程使溶剂重新充满再开始第二次输出，输出时间的长短决定于泵腔体积及输出流量。
3、进样器
液相色谱仪进样器普遍使用高压进样阀，用微量注射器将样品注入样品环管，使用的样品环管分别有不同的尺寸，可根据分析要求选用。当进样阀手柄放在吸液位置时，流动相直接通过孔的通路流向色谱柱，样品通过注射器从另外的位置进入样品环管，如果有过量的样品则会从出口孔排出，然后将手柄转到进样位置，此时流动相便将样品带进色谱柱。
4、色谱柱
色谱柱是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响到分离的效果。一般情况下色谱柱通常采用不锈钢管制成，并且柱内壁必须光洁平滑，否则内壁的纵向沟痕和表面多孔性也会引起谱带的展宽。柱接头的体积应尽可能小，柱长一般为10cm~25cm，内径4mm ~5mm。若使用直径为5μm~10μm固定相颗粒，理论塔板可达到 5×104/m。尺寸排阻色谱柱的内径通常大于5mm，制备色谱柱则会更大；为了减少溶剂用量，可采用微径柱，内径为1mm，长度为30mm~75mm，若采用3μm颗粒，理论塔板数高达1×105/m。
为了保护分析柱不被污染，有时需在分析柱前加一短柱，约数厘米长，此柱称为保护柱。为了防止保护柱过分增加柱阻力，在保护柱中使用的颗粒大小约为10μm~30μm。
5、检测器
液相色谱仪常用的检测器有紫外吸收检测器、光电二极管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器等。
二.原理
储液器中的流动相通过高压泵注入系统，试样溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，试样溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，因此，当两相相对运动，经过反复多次的吸附-解吸分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
高效液相色谱基本构造图（图源网络）
液相色谱仪的分类
液相色谱根据分离机理的不同可分为：液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱法、分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)等。
1、液-固吸附色谱
流动相为液体，固定相为固体吸附剂，是通过组分在两相间的多次吸附与解吸平衡实现分离的。适合分离的物质为中等相对分子质量的油溶性试样，凡是能够用薄层色谱分离的物质均可用此法分离。
2、液-液分配色谱
流动相和固定相都是液体的色谱法即为液液分配色谱。该方法是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂于载体上的固定相。可以分离各种无机、有机化合物
流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法。
流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法。
3、离子交换色谱
以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相，利用被分离组分离子交换能力的差别或选择性系数的差别而实现分离。
按照可交换离子所带电荷符号的不同又可分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。
离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离，在生物化学领域得到了广泛的应用。
4、离子对色谱法
将一种或多种与目标化合物离子电荷相反的离子（称为离子对）加入到流动相或者固定相中，使其与目标化合物离子结合形成离子对化合物，从而影响目标化合物的保留行为。离子对色谱和反相色谱有很多共同的地方。使用的固定相和流动相大致相似，不同的是，在离子对色谱的流动相中加入了离子对试剂。
离子对试剂通常分为以下两类：
用于酸性化合物：三乙胺，四丁基氢氧化铵，四丁基溴化铵，十二烷基三甲基氯化铵等。
用于碱性物质：三氟乙酸，戊烷磺酸钠，己烷磺酸钠，庚烷磺酸钠，辛烷磺酸钠，十二烷基磺酸钠，十二烷基硫酸钠等。
具体离子对试剂的选择没有什么特殊的要求，根据目标化合物的酸碱性进行选择就好。如果目标化合物是弱酸性或弱碱性的，离子对试剂对应选择强碱性或强酸性为最佳。
离子对色谱法特别适合一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。
5、分子排阻色谱法
分子排阻色谱法又称空间排阻色谱法（SEC）、凝胶色谱法，是利用多孔凝胶固定相的独特性产生的一种，主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离分析的方法。
适用于对未知样品的探索分离，它能很快提供样品按分子大小组成的全面情况，并迅速判断样品是简单的还是复杂的混合合物，并提供样品中各组分的近似分子量。这种分离方法不宜用于分子大小组成相似或分子大小仅差10%的组分分析，如同分异构体的分离不宜用分子排阻色谱法。
液相色谱仪常见故障处理
1.气泡溢出
流动相内有气泡,关闭泵,打开泄压阀,打开purg键,清洗脱气,气泡不断从过滤器冒出,进入流动相,无论打开purge键几次,都无法清除不断产生的气泡。原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时,轻轻震荡几次,再将过滤器用纯水清洗几次,打开泄压阀,打开purge键清洗脱气,如仍有气泡不断从过滤器冒出,继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏,流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1.0～3.0ml/min,纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲醇冲洗半小时即可。
2.柱压高原因
(1)缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内;
(2)样品污染沉积。处理对于第一种情况先用40～50℃的纯水,低速正向冲洗柱子,待柱压逐渐下降后,相应提高流速冲洗,柱压大幅度下降后,用常温纯水冲洗,之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再用换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
3.既无压力指示,又无液体流过
(1)泵密封垫圈磨损;
(2)大量气泡进入泵体。处理对于第一种情况,更换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。
4.压力波动大,流量不稳定
原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗。
5.出峰不佳,峰分叉
(1)色谱柱被污染;
(2)柱头填料塌陷。
处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定),再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料),装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧反复几次,直至装满填平。柱头用甲醇冲洗干净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30分钟以上。
6.峰面积重复性不佳
(1)进样阀漏液。
(2)加样针不到位。
(3)液量不足。
处理对于第一种情况更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态,以保证进样量的准确。日常工作中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱柱的使用寿命,同时避免注射过浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。
